Troppo modello in pcr

La quantità di DNA totale in una PCR ha un effetto marcato sull'esito di una procedura di PCR. L'utilizzo di una quantità eccessiva di DNA totale produce DNA compresso nello spazio ristretto del recipiente di reazione e può portare a un falso innesco e persino a una scarsa sintesi del DNA a causa della diffusione ostruita di grandi molecole di Taq polimerasi.

1. Quanto modello devo aggiungere alla PCR?
2. Troppo primer può inibire la PCR??
3. Cosa può causare il fallimento di una reazione PCR?
4. Quanto DNA è sufficiente per la PCR?

Quanto modello devo aggiungere alla PCR?

Anche se in teoria sarebbe sufficiente una molecola dello stampo, per una PCR classica vengono tipicamente utilizzate quantità considerevolmente maggiori di DNA, ad esempio fino a 1 µg di DNA genomico di mammifero e fino a 1 pg di DNA plasmidico (1).

Troppo primer può inibire la PCR??

I contaminanti nella miscela dNTP possono portare a un'amplificazione incompleta o errata o all'inibizione della PCR. Usa dNTP di alta qualità. L'uso di una concentrazione eccessiva di primer può aumentare la possibilità che i primer si leghino in modo non specifico a siti indesiderati sul modello o tra loro.

Cosa può causare il fallimento di una reazione PCR?

Dimenticare solo un componente della reazione PCR, che si tratti della DNA polimerasi, dei primer o persino del DNA stampo, risulterà in una reazione fallita. La soluzione più semplice è ripetere la reazione. ... Se non c'è ancora alcun prodotto PCR dopo questo, è probabile che ci sia qualcos'altro che ostacola la tua reazione.

Quanto DNA è sufficiente per la PCR?

In una tipica reazione da 50 µl, 1–2 unità di DNA polimerasi sono sufficienti per l'amplificazione del DNA bersaglio. Tuttavia, potrebbe essere necessario regolare le quantità di enzimi con modelli difficili. Ad esempio, quando nel campione di DNA sono presenti inibitori, l'aumento della quantità di DNA polimerasi può migliorare le rese della PCR.