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Risoluzione dei problemi di amplificazione PCR e RT-PCR
| Problema | Causa possibile |
|---|---|
| Nessuna banda sul gel | Il tempo di estensione era troppo breve |
| Il termociclatore non era alla temperatura corretta | |
| Bande extra non specifiche sul gel | Primer ibridati a un sito secondario sul modello |
| La contaminazione del DNA è stata introdotta in primer o tamponi |
- Cosa causa il fallimento della PCR?
- Come si risolve un problema di PCR??
- Cosa faresti se l'amplificazione PCR di un campione non fosse riuscita??
- Cosa succede quando si aggiunge troppo primer alla PCR?
Cosa causa il fallimento della PCR?
Di solito la prima cosa che fanno i ricercatori è incolpare un enzima o un reagente difettoso quando un esperimento fallisce, ma con la PCR è meno probabile che questa sia la causa del fallimento. La causa più spesso sono problemi interni più profondi come la progettazione del primer, i parametri del termociclatore o il legame non specifico ad altre sequenze di modelli.
Come si risolve un problema di PCR??
Controllare la capacità della lunghezza di amplificazione delle DNA polimerasi selezionate. Utilizzare DNA polimerasi appositamente progettate per PCR lunghe. Scegli DNA polimerasi ad alta processività, che possono amplificare bersagli lunghi in un tempo più breve. Ridurre le temperature di ricottura ed estensione per favorire il legame del primer e la termostabilità degli enzimi.
Cosa faresti se l'amplificazione PCR di un campione non fosse riuscita??
Se una reazione di amplificazione fallisce e si sospetta che lo stampo di DNA sia contaminato da un inibitore, aggiungere la preparazione di DNA sospetta a una reazione di controllo con un modello di DNA e una coppia di primer che si è ben amplificato in passato .
Cosa succede quando si aggiunge troppo primer alla PCR?
L'uso di concentrazioni più elevate di primer può avere i seguenti effetti: Se i primer sono in grado di formare dimeri, l'aumento della loro concentrazione determina solo la creazione di primer-dimeri e non migliora l'amplificazione del prodotto PCR desiderato.
